当前位置:首页  >  技术文章  >  超薄切片厚度和干涉色

超薄切片厚度和干涉色

更新时间:2023-11-21  |  点击率:351
通常会向超显微术的学生介绍大家周知的“Peachey图”。该图显示了切片厚度与它们在刀槽中漂浮时观察到的干涉色之间的关系,并被超微切片机的漫射白光照亮(Peachey,1958)。自从他的第一篇文章以来,早期的超微计制造商之一lvan Sorvall,lnc.制作了干涉色与切片厚度的图表,该图表被其他商业公司复制,并在电子微镜实验室中变得非常普遍。然而,这张图表是艺术家对Peachey的原始数据的再现,并没有准确地描绘出现代超微光度计改进的照明和设计所看到的颜色。因此,RMC Boeckeler进行了一项简单的研究,以显示干涉色,观察并拍摄了嵌入常用环氧树脂中的典型生物标本。

 


 


使用仪器
本研究使用了The RMC Boeckeler PowerTome。它配备了一个机械推进系统,该系统具有一个高重复性切割臂推进的精密数字线性标尺。这款先进的超高倍显微镜还配有触摸屏电脑和带高清摄像头的三目立体显微镜,用于拍摄切片时的图片和视频。该成像系统还有一个测量工具,可用于测量切片尺寸和面积,以便与样品块表面的尺寸和面积进行比较,从而估算切片压缩量。
程序
将小鼠脾脏固定在4%甲醛和1%戊二醛中,并后包埋在来自电子显微镜科学公司(EMS,哈特菲尔德,宾夕法尼亚州,美国)的Embed 812树脂中。这是一种常用的EPON812替代树脂,是许多实验室中用于生物标本的环氧树脂混合物的代表。按照制造商的说明,使用硬混合物。使用生产PT PCZ超薄切片机进行切片。使用Mitutoyo千分尺(型号#ID-C112E),通过独立的方法验证切割臂的机械前进,该测微计(千分尺)可以读取1um增量的线性距离。使用仪器控制器使切片臂前进10 um,并将这些距离与Mitutoyo千分尺在切割臂整个200um前进范围内的读数进行比较。这两个读数在1%的误差范围以内。切割臂的机械推进是通过步进电机和数字线性推(前)进系统的反馈控制来实现的,因此,超薄切片的较小推进预计也同样准确。例如,100纳米步进多个累加增量导致在Mitutoyo千分计上的读数与1微米和10微米的较大进阶相同。
在30nm至400nm范围内切割切片,并在切片时和在CHCI3蒸汽”拉伸”(减压)后拍照。设置相机的增益和曝光设置,使得生成的图像与通过立体显微镜直接观察到的颜色和亮度紧密匹配。使用图像处理软件lmageJ(NIH,USA)排列切片图像,以产生图2。

结果
RMC Boeckeler PowerTome PCZ稳定而精确的先进系统是切片典型环氧树脂包埋标本以记录切片干涉色的*佳选择。厚度在70纳米和100纳米之间的切片的金色的细微变化很容易区分。在170纳米附近可以看到明亮的蓝色,比Peachey最初在旧仪器上报告的190纳米到240纳米要薄得多。
图2显示了CHCla”拉伸“的切片截面,这是许多实验室的准技术。其他人经常使用一种装置,使加热的丝经过该部分,以获得该部分的类似减压。切片的解压缩有利于改善切片在透射电子显微镜(TEM)的光束内拉伸和移动的效果。我们发现,与样品块面相比,截面长度压缩了大约10%。在CHClg拉伸后,压缩减少到约8%。因此,这些部分的实际厚度可以等效地减小。图2是由一台仪器制作的实际切片构建而成,该仪器被证实是精确的,为超微切片师提供了更精确和更新的参考,因此比以前由艺术家制作和商业发行的图表更有用。此图表还涵盖了更大的厚度范围,展示了一些干涉色如何随着切片厚度的增加而重复出现。
参考Peachey,L.D.(1958)J.Biophys。生物化学Cytol.4,233.
Sjo strand,F.S.(1967)细胞和组织的电子显微镜 Electron Microscopy of Cells andTissues281-287。